Germ-Cell-Specific Inflammasome Component NLRP14 Negatively Regulates Cytosolic Nucleic Acid Sensing to Promote Fertilization
文献信息：
Abe T , Lee A , Sitharam R , et al. Germ-Cell-Specific Inflammasome Component NLRP14 Negatively Regulates Cytosolic Nucleic Acid Sensing to Promote Fertilization[J]. Immunity, 2017, 46(4):621-634.
文献摘要：细胞质对核酸的识别会触发严密的调控程序，进而限制感染（因为核酸很少直接出现在细胞质中，一旦出现，宿主细胞可以将其视为这一种“危险”信号）。卵母细胞的受精代表了这样一种情况，在受精过程中，精子中的DNA会进入卵母细胞，这是一种外源DNA，但不是病原体的DNA，如果是病原体的DNA，则会造成严重后果。作者假设生殖细胞在稳定状态下，会表达一些核酸识别（NAS）的负向调控因子，抑制卵母细胞对精子DNA的识别。作者通过对公共数据进行挖掘，使用功能基因组的方法确定了一个DNA与RNA识别的变阻器（rheostat），即炎性小体NLRP14。作者后续的实验结果表明，NLRP14能与核酸识别通路相互作用，并与TBK1（TANK binding kinase 1）相互作用，使TBK1泛素化，并降解。最终，作者还发现了一个人类无义胚系突变体（nonsense germline variant），该突变体与男性不育有关，此突变会导致NLRP14功能的功能缺失，造成对核酸产生高反应性（hyper-responsiveness）。作者的这项发现提示了核酸调控的一种机制，并对受精的过程研究有着重要意义。
注：无义突变（nonsense mutant）是编码某一氨基酸的三联体密码经碱基替换后，变成不编码任何氨基酸的终止密码UAA、UAG或UGA。虽然无义突变并不引起氨基酸编码的错误，但由于终止密码出现在一条mRNA的中间部位，就使翻译时多肽链的终止就此终止，形成一条不完整的多肽链。
研究工作的重点：
1. 确定了NLRP14是一个生殖细胞特异性核酸识别的抑制剂。
2. NLRP14能与调控cGAS/RIG-I信号能占相互作用。
3. NLRP14能靶向作用于TBK1，使其降解，抑制DNA与RNA识别。
4. 与男性不育有关的SNP会导致NLRP14功能的缺失。
Introduction部分
第一段讲了所有生物的天然免疫系统，所有生物的免疫系统是用于识别非己与自己的系统，使用细胞表面的一些受体用于识别糖，脂，多聚物，核酸等。
第二段讲了脊椎动物检测核酸的天然免疫受体，其特征是产生I型干扰素，例如IFN-α/β。但脊椎动物的这些免疫反应要受到严格调控。RIG-I是全称是retinoic acid-inducible gene 1，它是一个细胞质识别RNA的受体，能分辨外源的RNA。cGAS的全称是cyclic GMP-AMP synthase，STING的全称是stimulator of interferon genes，cGAS-STING协同识别细胞质中的DNA。但是在受精过程中，生殖细胞来源的DNA有可能出现在卵母细胞的细胞质中，按照常规思路，此时DNA会诱发识别核酸的应答（但是事实上这种情况并没有出现）。因此，作者推断，生殖细胞必然存在着一种负向调控机制用于调控受精过程中核酸的识别。
第三段，为了寻找这样的负向调控机制，作者挖掘了相关的数据库，寻找在受精过程中生殖细胞在受精后那些下调的基因。作者接下来对这些基因进行了功能基因组筛选，确定了NLRP14（NACHT, LRR and PYD domains-containing 14）是一个核酸识别变阻器。作者进行了NLRP14的异位表达（异位表达：自然状态下细胞内大多数基因表达都有组织特异性和诱导表达性，人为操纵外源基因的导入和表达称之为异位表达， ectopic expression），结果显示这会导致细胞质核酸识别途径的功能丧失。相反，用CRISPR介导的NLRP14敲除能增强DNA和RNA的识别，并扩大促炎性细胞因子的释放。作者的结果还显示，NLRP14能与核酸识别途径相互作用，这些途径上的蛋白包括STING，RIG-I，MAVS（mitochondrial antiviral signaling protein）与TBK1。此外，作者的数据还显示，NLRP14能靶向作用于TBK1，使TBK1泛素化并降解。NLRP14与TBK1相互作用的结构域也有抑制功能。最终作者还发现，人类一个与男性不育相关的无义胚系突变体（nonsense germline variant）也能导致NLRP14功能的缺失，并能增强核酸的应答。
先看第一个数据：NLRP14是细胞质核酸识别的一个候选调节因子
作者挖掘了GTEx数据库，这个数据库的全称是Genotype-Tissue Expression，网址是https://commonfund.nih.gov/GTEx/。GTEx这个数据是由NIH于2010年发起的，主要专注于理解人类基因的变化是如何导致疾病产生的。此数据库中有人类不同组织中不同基因的表达数据。作者寻找了那些优先表达在睾丸和卵巢中的基因，因为这两个器官是与受精最密切的两个器官，作者找到了1180个基因，这些基因表达在睾丸和卵巢，不表达在其它器官。作者又将这些基因的数目进行了缩减，其依据就是，这些基因在受精后，表达下降。因为在受精过程中，可能需要NAS的抑制，但在随后的情况中，NAS的抑制又是必需的，否则会造成严重后果。最终作者确定了20个候选基因。这20个基因在受精后表达量下降（我的理解就是，先寻找在生殖器官中特异性表达的基因，有1180个，这1180个基因必然在生殖过程中发挥作用，随后再将这些基因的数目进行缩减，缩减的依据就是在受精过程中下调的基因，因为在正常情况下，这些基因正常表达，发挥核酸识别的作用，在受精的过程中，核酸的识别要受到抑制，因此这些基因要下降，就是说不能让核酸的识别作用太强）。第一张图：数据挖掘的结果如下所示：
数据挖掘后，再接着就是对这些基因进行功能筛选，作者使用的手段就是在293T细胞中表达细胞质DNA识别器。293细胞的全称是HEK293细胞系，即人类胚胎肾细胞系。这种细胞本身不表达细胞质DNA识别受体。因此作者构建了HA标记的STING293T细胞系，即293T-STING-HA。随后将这20个基因进行亚克隆到这个稳转细胞系中。使用的载体是pLenti6.2-V5，将这些候选基因与cGAS以及ISRE启动子报告基因共同转进前面的293T-STING-HA细胞中（ISRE是一个启动子，它的激活通常是cGAS和STING协同介导的，dsDNA先与以GAS结合，然后与STING结合，最后再与ISRE启动子结合），第一fig中只放了17个基因的结果，作者的文献中提到了，成功进行了17个基因的亚克隆。其中抑制了cGAS介导的ISRE启动子活性超过了40%的有：TRIM42，TGIF2Lx，C4orf42，ZPLD1与NLRP14。
作者提到，只研究了NLRP14，因为NLRP14的抑制效果最好。在作者的附件中还提到，在受精后，NLRP14的下降程度最高。总之，作者在这一部分中，通过数据挖掘与功能筛选，找到了NLRP14作为研究对象。
结果2：NLRP14能负向调控PRR介导的信号转导
Fig2A-识别DNA的信号通路是cGAS-STING-TBK-IFR3，此信号通路会诱导I型干扰素的产生，例如IFN-gamma。其中最关键的一个成员就TBK1，TBK1会磷酸化IRF3与IRF7（后者的程度要浅一些）。
Fig2B-为了研究NLRP14对细胞质DNA识别通路的影响，作者将HA标记的STING，或FLAG标记的TRIF，TBK1，IRF3和IRF7，以及N端Myc标记的NRLP14与ISRE或NF-kappaB报告质粒地共同转染到293F细胞中。B中是TBK1，TRIF，STING的结果。
Fig2C-接上图。这是RIG-I与MAVS的结果。B图与C图都显示，NLRP14的抑制作用偏向于IRF3的信号通路。
Fig2D-NRLP14也能降低RIG-I和MAVS诱导的IRSE与NFkappaB启动子。
Fig2E-NLRP14能抑制TBK1介导的IP10，IFN-beta mRNA水平降低。
结果3-构建NLRP14敲除的293T细胞系
一些肿瘤与永生化细胞系（例如293T）中会表达中午水平的NLRP14。为了研究NLRP14的作用，作者使用CRISPR敲除了NLRP14（这个细胞就是前面使用了表达了STING的293T细胞）。然后转染cGAS-Flag或cGAMP。
Fig3A-转染cGAS,cGAMP，能明显增加ISRE的启动子活性，以及提升IFNβ的荧光强度。这说明，NLRP14确实有减少cGAS-STING信号通路的强度。红色的是敲除了NRLP14的细胞。
Fig3B-转染B-DNA，polyIC，DNV也能明显增加ISRE的启动子活性，以及提升IFNβ的荧光强度。
Fig3C-转染B-DNA，NDV，敲除了NLRP14的293中的IFNbeta，IP10,IRF7,ISG15的mRNA水平都上升。
Fig3D-在敲除了NLRP14的293细胞中，STING，RIG-I，TBK1与MAVS的mRNA水平也上升。
Fig3中的数据表明，过表达NLRP14会导致NAS降低，敲除NLRP14会导致NAS介导的信号通路与抗病毒相关的免疫通路中mRNA上升。
结果4-NLRP14能与NAS中的一些成分进行结合
主要是通过Co-IP的手段来研究NLRP14能否与NAS中的一些成分有相互作用。DNA与cGAS结合后，会产生cGAMP，这是一个第二信使，导致STING介导的TBK1活化。在fig4中，就是研究了NRLP14能否与cGAS/STING和RIG-I介导的信号转导有相互作用。
fig4A-NLRP14是否能与外源表达的cGAS和/或STING相互作用，NLRP14能与STING相互作用，不与cGAS相互作用。fig4A中的大括号上面，也就是IP:FLAG，表示的是用FLAG抗体来拉蛋白，IP的意思就是immunoprecipitation，即免疫沉积，也就是用蛋白A的抗体来拉某个混合物中的蛋白，这里的混合物就是文献中的提到了293T细胞裂解液。
Fig4B-在293T-STING-HA细胞中共表达Myc-NLRP14与HA-cGAS，一共可以分为三组：第一组：表达STING-HA与HA-cGAS的细胞，第二组：表达Myc-NLRP14和STING-HA的细胞；第三组：表达STING-HA，HA-cGAS，Myc-NLRP14的细胞。从结果可以看出①第二组，第三组中含有NLRP14，STING，并且第三组中NLRP14的量多；②在含有cGAS的条件下，NLRP14的量增多了；③p-IRF3是IRF3磷酸化的抗体，在第三组中检测到了此蛋白，说明在cGAS,STING存在的情况下，IRF3发生了磷酸化，如果再加上NLRP14，则IRF3磷酸化水平降低，说明NLRP14有抑制IRF3的作用。A图与B说明，NLRP14也许会通过与STING相互作用来参与DNA的识别。
Fig4C-研究NLRP14对TBK1-STING相互作用的影响，使用的是普通293T细胞。结果发现，NLRP14增加时，TBK1与STING相互作用减弱。B与C的结果说明，NLRP14是通过干预STING-TBK1信号复合体来抑制下游的IRF3的磷酸化（某个蛋白的磷酸化，就是说明这个蛋白激活）。
Fig4D-NLRP14还能干预其他的信号分子，例如RIG-I，MAVS，TBK1相互作用，例如在NDV的感染（NDV能诱发TBK1介导的IRF3活化）过程中，NLRP14能抑制IRF3的磷酸化。
结果5-NLRP14的N端结构域发挥抑制TBK1介导的IFN-β的产生的作用
Fig5A-在这一部分的实验中，作者要构建了NLRP14的各种突变体，将NLRP14的各处的氨基酸分别进行了删除。
Fig5B-其中Δ1-100和Δ531-1093这两个突变体能明显抑制TBK1介导的IFN-β和NF-κB的启动子活性。Δ1-345这个突变体的抑制功能则消失。说明NLRP14发挥抑制功能的区域是1-345这段氨基酸。
Fig5C-293T共转染TBK1与NLRP14突变体后，IFN-β和NF-kappaB的活性变化，从结果中可以发现，Δ1-345这个突变体IRF3磷酸化的水平不变，其他的突变体中，IRF3磷酸化的水平受到抑制。
Fig5D-293T细胞共同转染NLRP14，以及NLRP14的各种突变体，观察它们与TBK1的相互作用，从中可以发现，Δ1-345这个突变体的效果与空白对照组是相同的。Δ-531-1093-FL与NLRP14-FL的效果是相同的。
Fig5E-Δ1-345突变会无法抑制内源性IP10，IFN-beta的mRNA的产生。
结果6-TBK1与NLRP14相互作用的结构域，NLRP14能诱导TBK1的泛素化
为了确认TBK1结构域的哪部分与NLRP14相互作用，作者构建了TBK1的各种突变体。将它们与Myc-NLRP14共同转染到293T细胞中观察结果，其中fig6D的结果显示，1-305这个突变体参与了TBK1与NLRP14的相互作用，这说明是TBK1的N端激酶结构域（KD）参与了这个相互作用，另外，fig6C的结果显示，TBK1的激酶死亡突变（S172A）并不能消除这种相互作用，这说明，此激酶活性并不参与TBK1与NLRP14的相互作用，如下所示：
前面的实验说明了，NLRP14能与TBK1相互作用，并且能够通过这种相互作用来抑制cGAS-STING信号转导。接着作者研究了这种相互作用是如何消除TBK1介导的信号通路的。Fig5C的结果说明，在NDV感染的过程或者不感染的情况下，外源表达NLRP14能抑制TBK1蛋白的下降。因此作者假定，NLRP14抑制TBK1有可能是通过泛素化途径实现的。
Fig6E-向293T细胞同时转染TBK-FL，Myc-NLRP14，HA-Ub，使用FLAG来拉蛋白，，使用HA来鉴定，发现出现了多聚泛素化的条带。并且TBK1的水平会降低。
Fig6F-Δ1-345的突变不会导致TK1的多聚泛素化。
Fig6G-有文献报告，TBK1可能发生K48，K63的多聚泛素化，但K48R与K763R的TBK1突变体不会发生由NLRP14诱导的多聚泛素化。这说明TBK1由NLPR14介导的泛素化是非K48依赖的。
Fig6D，FIG6H-全称的TBK1，ΔCC与ΔULD-CC突变体会被NLRP14多聚泛素化。这说明TBK1的激酶结构域（KD），因为这两个突变体中是分别将CC，ULD结构域给敲除了，只剩下了KD没有被敲除，因此推断出了KD可能是发挥功能的区域。
有文献报告，NLRP4与NLRP14离有38的同源区域，其中NLRP4能负向调控RNA识别，其机制是诱导TK1泛素化。作者此时研究了NLRP4与NLRP14是否有相同的功能。当用NDV或poly(I:C)来感染NLRP4-CRISPR-293T时，此细胞表现出强烈的应答。这说明，NLRP4与NLRP14有着类似的功能。但过在NLRP4-CRISPR-293T细胞中过表达NLRP14则表现为TBK1的泛素化，抑制TK1的磷酸化，抑制TBK1介导的ISRE和NKκB启动子活性。这说明，NLRP4独立于NLRP14的作用途径。此外，作者还发现，NLRP14能抑制某个TBK1的突变体，此突变体为K670R，其中K670能与DTX4依赖的泛素化途径结合，降解TBK1，这说明NLRP14诱导的TK1的泛素化是由另外一个独立于K670的方式实现的，还需要进一步的研究。
结果7-NLRP14对NAS调控的负反馈机制
MAVS是位于线粒体上的一个脚手架蛋白，在识别RNA的RIG-I通路方面有着重要作用。Fig4D的结果说明，NLRP14能与MAVS相互作用。但是作者研究发现，MAvs，STING的表达会降低NLRP14的蛋白水平（fig4A与fig4D）。有文献报道，MAVS的跨膜区域参与线粒体的定位与转导。
Fig4E说明，过表达MAVS的一个个突变体，即MAVSΔTM（跨膜区域缺陷型）会导致其与NLRP14相互作用的完全消失。
Fig4F说明，过表达STING的一个突变体（I200N）能与NLRP14相互作用，而野生型STING则能降低NLRP14的水平。为了研究NLRP14降低的分子机制，作者使用了蛋白酶体抑制剂MG132，以及自噬抑制剂巴佛洛霉素A1。经巴佛洛霉素A1干预后的细胞，MAVS诱导的NLRP14水平降低程度未变。但MG132处理后，NLRP14的水平恢复。这说明，MAVS定位与信号转导参与蛋白酶体降解的NLRP14.
为了研究哪个元件控制NLRP14的降解，作者使用了NLRP14的各种突变体（分别为PYD缺陷型，NACHT缺陷型，LRR缺陷型）。将它们连同MAVS或STING共同转染到293T细胞中。其中，PYD，NACHT结构域缺陷的NLRP14不影响MAVS或STING诱导的NLRP14降解。但LRR缺陷的NLRP14则能抑制这种降解。这说明是LRR结构域参与稳定了NLRP14。并且ΔLRR-NLRP14能增强对TBK1和STING介导的INF-β启动子活性的抑制。作者还猜测，NLRP14存在着两种构建，它们发挥不同的功能，因为删除LRR会导致PYD与NACHT结构域的暴露，它们参与抑制细胞质中核酸识别受体的途径。这种开/关调控或许就说明了NLRP14在生理过程中并非总是一直发挥作用，例如在受精过程中，这种作用就会关掉，如fig7E所示。
结果8-NLRP14的SNP导致了NAS途径的抑制
有文献报告，NLRP14的一些突变会导致男性不育。为研究这些突变与NLRP14免疫抑制的关系。作者构建了这些突变的各种突变体。
Fig7A-NLRP14的突变以及已经确定的男性不育的SNPs结构。
Fig7B-突变体对IFNbeta荧光报告基因的抑制情况。
Fig7C-做实业这体对TBK1，IRF3磷酸化水平的恢复情况，即在突变体中，NLRP14抑制TBK1的功能出现异常，TBK1的磷酸化水平就会恢复。
Fig7D-突变体不与TBK1结合，并且TBK1泛素化水平明显降低。